實時熒光PCR是一種高效、快速、靈敏的核酸檢測技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。實時熒光PCR試劑盒是分析的常用試劑，本說明書將詳細(xì)介紹其使用方法和注意事項。
一、實時熒光PCR試劑盒組成
1.TaqDNA聚合酶：用于DNA的擴(kuò)增，負(fù)責(zé)將引物與模板DNA的單鏈DNA酶加速退化并使其DNA合成。
2.PCR反應(yīng)緩沖液：含有適當(dāng)?shù)木彌_劑，pH9.0，用于維持PCR反應(yīng)體系的酸堿度，包含MgCl2及其它試劑，在PCR反應(yīng)中也是擴(kuò)增的重要條件之一。
3.dNTPs混合物：包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種核苷酸，是DNA分子的構(gòu)成單位和擴(kuò)增反應(yīng)的原料。
4.SYBRGreenI染料：用于熒光定量的染料。
5.引物：包括前向和反向引物，定位于待擴(kuò)增的基因序列5’端和3’端；
二、試劑盒存儲
實時熒光PCR試劑盒應(yīng)在-20℃下儲存，避免陽光直射和高溫。試劑從冷凍箱取出后，空冰盒應(yīng)放回-20℃冰箱中保存；反復(fù)凍融次數(shù)不宜過多，應(yīng)遵循一次性使用的原則。
三、試劑配制
1.TaqDNA聚合酶
將試劑盒中的TaqDNA聚合酶稀釋至10U/μL，如果使用種類不同的TaqDNA聚合酶，需按照不同試劑盒的說明書配制濃度。
2.PCR反應(yīng)緩沖液
取10XPCR反應(yīng)緩沖液一袋，加入適量的雙蒸水再混合融合，在處理前搖勻。
3.dNTPs混合液
將試劑盒中的dNTPs混合液稀釋至各1mM濃度，即每個dNTPs的表面濃度為10mM。
4.引物
引物需由用戶根據(jù)需要設(shè)計并合成，最佳濃度為0.2μM，初次擴(kuò)增可以進(jìn)行濃度梯度PCR。
四、PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)體系根據(jù)不同試劑盒而異，但以下條件必須滿足：
1.反應(yīng)總體積為20μL；
2.TaqDNA聚合酶濃度為0.02U/μL；
3.濃縮PCR緩沖液為10X，含有適量的鎂離子，按實驗設(shè)定的模板DNA濃度進(jìn)行配制；
4.引物濃度為0.2μM；
5.dNTPs濃度均為1mM。
五、實驗操作
1.取模板DNA
提取模板DNA應(yīng)避免污染，可通過UV檢測濃度。
2.根據(jù)擴(kuò)增位點(diǎn)設(shè)計合適的引物
應(yīng)合理設(shè)計引物，確保引物的特異性、合適的長度、最佳的表面濃度、最適的擴(kuò)增溫度、避免二聚體生成等。不同種類的引物按不同的擴(kuò)增步驟使用，避免混合誤判。同時，應(yīng)使用專業(yè)的引物設(shè)計軟件，如Primer3、Oligo等，確定引物序列。
3.PCR反應(yīng)設(shè)置
根據(jù)實驗需要進(jìn)行PCR反應(yīng)體系設(shè)置，并通過實驗室實驗驗證修正，確保反應(yīng)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。反應(yīng)過程中應(yīng)進(jìn)行一次性使用、避免污染、使用厭氧比色卡等方法進(jìn)行檢測控制。
4.擴(kuò)增優(yōu)化
對PCR反應(yīng)能否成功，引物濃度、反應(yīng)緩沖液pH值、MgCl2濃度、反應(yīng)溫度和時間等條件均有很大影響，應(yīng)花費(fèi)相應(yīng)的時間進(jìn)行優(yōu)化，并針對不同的DNA片段進(jìn)行個性化優(yōu)化。
5.片段純化和測序
提取PCR產(chǎn)物，并將其用試劑盒進(jìn)行純化；成品片段用測序儀進(jìn)行檢測，樣品需要通過ABI310測序儀檢測、測序質(zhì)量檢測、樣品的星號，出欄和質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有較高的強(qiáng)相關(guān)性。對出現(xiàn)熒光異常需開發(fā)相關(guān)處理規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)化解釋方法，確保檢測的準(zhǔn)確性。
六、注意事項
1.試劑盒應(yīng)避免長時間在高溫環(huán)境下存放，否則可能導(dǎo)致試劑盒中的部分試劑失效；
2.PCR反應(yīng)的準(zhǔn)備和加藥時，應(yīng)使用專門的工具，在實驗室避免交叉污染；
3.擴(kuò)增條件須符合說明書說明，必須按照說明書中的條件嚴(yán)格執(zhí)行，否則可能導(dǎo)致試劑盒效果不佳；
4.試劑盒內(nèi)各部分試劑的含量應(yīng)按說明書標(biāo)記為準(zhǔn)，避免誤操作導(dǎo)致實驗失敗。
七、結(jié)論
實時熒光PCR試劑盒是提高檢測效率和準(zhǔn)確性的重要工具。通過科學(xué)準(zhǔn)確地使用和操作，可確保擴(kuò)增效果和結(jié)果的準(zhǔn)確性。
