RNA提取技術(shù)

細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過不同方式去除蛋白，DNA等雜質(zhì)，終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。

RNA提取技術(shù)流程

細(xì)胞裂解

異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）

這是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差。

該法應(yīng)用非常廣泛，適用于包括動(dòng)物組織、微生物、培養(yǎng)細(xì)胞等在內(nèi)的各類動(dòng)物性材料，同時(shí)還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。該法主要應(yīng)用在動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取中。

胍鹽/β-巰基乙醇法

RNA提取技術(shù)適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料。

在這種方法中，胍鹽使細(xì)胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實(shí)驗(yàn)全程中可以抑制RNaseA的活性，保護(hù)RNA不被降解。

其它方法

有些植物材料多糖多酚含量較高，如植物果實(shí)，番茄的葉子等，有些植物木質(zhì)化程度較高，如根莖等組織。針對(duì)這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑，該試劑特別適合于從富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA，有關(guān)的具體步驟將在分論中詳細(xì)介紹，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自己的需要進(jìn)行選擇。

1.樣品處理

從各種不同來源樣品（如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、植物組織和培養(yǎng)細(xì)胞）,或同一來源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等）中提取高質(zhì)量的RNA，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，樣品預(yù)處理的方式也各有差異。

樣品的要求

使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品，避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致提取的RNA降解和提取量下降。

樣品預(yù)處理方式

植物材料-液氮研磨

動(dòng)物材料-勻漿、液氮研磨

細(xì)菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁

硅基質(zhì)吸附法

隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見的有：硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹脂和磁珠等。硅基質(zhì)吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚等優(yōu)點(diǎn)，成為核酸純化的S選。

RNA提取技術(shù)純化及獲得

純化要求

RNA樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。

純化方法及沉淀

方法一：有機(jī)溶劑抽提法

抽提

在使用RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取時(shí)，常使用進(jìn)行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)，并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離，從而達(dá)到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產(chǎn)品中，與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。

沉淀

抽提RNA后，一般采用了異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，可獲得RNA沉淀。

溶解沉淀

加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

纖維組織

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于*破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織中RNA含量較低，建議增加起始量。此外，一定要在液氮中將組織*磨碎。

蛋白/脂肪含量較高的組織

腦或植物脂肪含量高，酚抽提后，上清含白色絮狀物。必須用再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。

RNA提取技術(shù)純度檢測---分光光度計(jì)法

通過OD260/280來檢測RNA純度，OD260/230作為參考值。

OD260/280在1.9-2.1之間，可以認(rèn)為RNA的純度較好；

OD260/280值小于1.8，則表明蛋白雜質(zhì)較多；

OD260/280值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；

OD260/230值小于2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。

注意：如果用TE溶解或洗脫RNA，會(huì)使OD260/280值偏大。