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雞傳染性支氣管炎病毒抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）
使用說明書
【產品名稱】
通用名：雞傳染性支氣管炎病毒抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法）
英文名：Test Kit for Antibodies to Infectious Bronchitis Virus (ELISA)
【包裝規格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒
【預期用途】 雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起雞的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道傳染病，本病呈世界性分布，是嚴重危害養禽業的主要疫病之一。疫苗免疫是預防和控制雞傳染性支氣管炎發生的有效途徑，而免疫后抗體水平的高低反映實際的疫苗免疫效果，直接關系到免疫雞群對禽流感病毒的抵抗力。
雞傳染性支氣管炎抗體檢測試劑盒(酶聯免疫)適用于：雞血清抗體的檢測，以確定被檢雞是否感染過雞傳染性支氣管炎病毒或免疫雞體內抗體水平；評估雞群感染IBV的風險程度；了解雛雞母源抗體水平，為IBV免疫程序的制定提供參考。
【原 理】
雞傳染性支氣管炎抗體檢測試劑盒(酶聯免疫)由預包被雞傳染性支氣管炎病毒重組N蛋白的酶標板、酶標記物及其他配套試劑組成，應用酶聯免疫法（ELISA）原理檢測雞血清或血漿中雞傳染性支氣管炎病毒抗體。實驗時，在酶標板中加入對照血清和稀釋的待檢血清，經溫育后，若樣品中含有雞傳染性支氣管炎病毒的抗體，則將與酶標板上抗原結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后；再加入酶標記物，與酶標板上抗原抗體復合物發生特異性結合；再經洗滌除去未結合的酶結合物，在孔中加TMB底物液，與酶標結合物反應形成藍色產物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關；加入終止液終止反應后，產物變為黃色；用酶標儀在450nm波長測定各反應孔中的吸光值，即可知樣品是否含有傳染性支氣管炎病毒抗體。
【試劑盒組成】
序號 | 名稱 | 規格/96T×1 | 規格/96T×2 | 規格/96T×5 |
1 | 酶標記物 | 11ml×1(紅蓋) | 11ml×2(紅蓋) | 26ml×2(紅蓋) |
2 | 樣品稀釋液 | 50ml×1(黃蓋) | 50ml×1(黃蓋) | 200ml×1(黃蓋) |
3 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml×1(白蓋) | 40ml×1(白蓋) | 200ml×1(白蓋) |
4 | 底物液A | 6ml×1(白蓋) | 11ml×1(白蓋) | 26ml×1(白蓋) |
5 | 底物液B | 6ml×1(黑蓋) | 11ml×1(棕蓋) | 26ml×1(黑蓋) |
6 | 終止液 | 6ml×1(黃蓋) | 11ml×1(黃蓋) | 26ml×1(黃蓋) |
7 | 陽性對照 | 1.0 ml×1(紅蓋) | 1.5 ml×1(紅蓋) | 2.0 ml×1(紅蓋) |
8 | 陰性對照 | 1.0 ml×1(綠蓋) | 1.5 ml×1(綠蓋) | 2.0 ml×1(綠蓋) |
9 | 酶標板 | 96T×1 | 96T×2 | 96T×5 |
10 | 蓋板膜 | 1 | 2 | 5 |
11 | 自封袋 | 1 | 1 | 2 |
12 | 說明書 | 1 | 1 | 1 |
13 | 稀釋板 | 1 | 2 | 5 |
【儲存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個月。
包被板開封后請于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個月。
【適用儀器】 含450nm、630nm波長的酶標儀，37℃恒溫設備，可調微量移液器。
【樣品準備】
1.取動物全血按常規方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。
2.用樣品稀釋液將待檢血清先按10倍稀釋（如在稀釋板中加入90μl樣品稀釋液再加10μl血清，混勻）。陰、陽性對照不用稀釋。
3.濃縮洗滌液使用前應恢復至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。
【檢驗方法】
1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復至室溫。
2.取所需用量酶標板條，設空白對照1孔、陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。
3.空白對照孔加樣品稀釋液100μl；陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照100μl；樣品孔每孔加入樣品稀釋液90μl，再加入稀釋后的血清10μl。
注：樣本稀釋比例相當于1:100。
4.混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應30分鐘。
5.甩去孔內液體，每孔加350 ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，后一次拍干。
6.每孔加酶標記物100μl（空白孔除外）。蓋好蓋板膜，置37℃避光反應30分鐘。
7.洗滌，同步驟5。
8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應10分鐘。
9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值），無參比波長用空白孔調零(即所有孔吸光值減去空白孔吸光值)。
【參考值】 實驗正常的情況下，陰性對照≤0.10，陽性對照≥0.6。
【檢驗結果的解釋】
1.C.O（臨界值）=0.13+陰性對照孔均值（陰性對照孔均值低于0.07時以0.07計算）。
2.未曾免疫雞群：樣品A值≥C.O為陽性；樣品A值＜C.O為陰性。
3.免疫雞群：監測并記錄樣本當時的抗體水平，根據結果分析抗體水平的分布及雞群免疫狀態的動向。
【試驗方法的局限性】
該試驗僅作為定性檢測雞血清或血漿中雞傳染性支氣管炎病毒IgG抗體，根據A值高低可作抗體水平強、中、弱的粗略評估。
【注意事項】
1.實驗操作時需戴手套、穿工作衣，嚴格健全和執行消毒隔離制度，各種實驗廢棄物都應按傳染物處理。
2.終止液具有腐蝕性，應避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。
3.酶標板從冷藏環境中取出時應恢復至室溫方可開袋，未用完的酶標板需放入有干燥劑的密封袋中保存。
4.濃縮洗滌液在低溫時容易結晶，使用時需恢復至室溫以*溶解。
5.洗滌時各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。
6.用于檢測的樣品應保持新鮮。
7.試驗結果的判定必須以酶標儀讀數為準。
8.不同批號試劑組分不得混用。
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